对于中药来说，成分是不同中药材发挥药理作用的基础，因此成分的鉴定对于后续药理作用机制的研究具有重要的意义。
而中药在正式成为一味药材之前，从产地生产到复方熬制要经历不同的阶段，这些不同阶段的成分变化研究也可以辅助我们更好地应用中药于治疗，建立更加完善的中药质量控制系统。对于通过口服的中药复方，一般来说会进入血液或者运输到肠道，进入血液中的中药成分会随着血液运行到作用组织部位发挥效用，因此对于入血成分的鉴定（血清药物化学）可以直观地获取到拟发挥效用的成分，为后续的血清药理研究奠定物质基础；而运输到肠道的成分则无法被血液吸收，通过影响肠道微生物来改善疾病状态，本篇我们重点来看一篇中药入血成分文章的研究思路。
这篇文章是由中国中医科学院黄璐琦院士团队和中国科学院微生物研究所高福院士团队联合发表在PNAS上的一篇关于新型冠状病毒肺炎治疗药物Q-14药效成分的研究。
研究背景
Q-14是著名的新型冠状病毒肺炎治疗药物，已于2021年获得国家药监总局批准，制成颗粒（Q-14），由14种中草药组成，君：麻黄、广藿香、石膏，臣:苦参、半夏、厚朴、苍术、草果、茯苓，佐：黄芪、柏树、芍药、大黄，使：甘草。
一些临床试验表明，Q-14对SARS-CoV-2 RNA清除、促进肺病变混浊吸收、减轻炎症和改善流感样症状（如喉咙痛和胸痛）具有较好的效果，这表明Q-14可能具有强大的抗病毒和抗炎作用。在以往的研究中，Q-14已初步鉴定出217种成分，并基于计算生物学和网络药理学假设Q-14中一些潜在的生物活性成分（如槲皮素、木犀草素、山奈酚、大黄素、大黄酸）具有抗病毒和抗炎特性。然而，由于缺乏系统和深入的研究，Q-14的TCMT - NDRD用于COVID-19管理的研究进展甚微。
研究结论
1. 通过代谢组对Q-14复方和血浆样本进行检测，在复方中检测到343种物质，在血浆中检测到来自复方地60种原型成分；
2. Q-14复方中有10种成分具有较好地抗病毒功能，另外30种化合物具有较好地抗炎效果，其中甘草查尔酮B、西北甘草异黄酮和刺甘草异黄酮表现出最强大的抗炎活性，且存在剂量效应；
研究结果
1. Q-14在体内降低SARS-CoV-2病毒载量，缓解肺部炎症
之前的研究已经建立了hACE2转基因小鼠，用于研究Q-14对COVID-19的抗病毒和抗炎作用。模型对照组和治疗组感染后5 d的平均体重减轻率（dpi）分别为4.86%和4.17%。模型对照组肺组织中位病毒载量为106.84拷贝/mL，经Q-14处理后略有下降（106.42拷贝/mL）。Q-14治疗组炎症因子如MCP-1、MIG、IP-10/CXCL-10、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10和IL-1α的表达均显著降低（p < 0.05），而IL-17A和IL-12p70在模型对照组和治疗组之间无明显差异。肺病理变化方面，模型对照组表现为中度间质性肺炎，而Q-14治疗组肺部炎症明显改善。
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图1. Q-14对COVID-19的抗病毒和抗炎作用
2. Q-14化合物谱的表征
作为一个非常复杂的处方，准确、高通量地表征Q-14中的化合物是TCMT - NDRD的先决条件。利用代谢组学技术对Q-14的化学成分进行鉴定，共鉴定出343种化合物，包括70种黄酮类化合物、46种三萜皂苷、33种萜类化合物、29种生物碱、28种苯丙素、26种糖苷、21种酚酸、21种单宁、20种苯乙醇苷、14种蒽醌、13种木脂素、8种脂肪酸和Q-14中的其他14种化合物（图2 A-C）。
进一步对不同药材及其成分的数量进行总结（图2D）。值得注意的是，一些化合物在几种草药中同时被鉴定，如DH、TLZ、GC、CG、MH和CS中的槲皮素。
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图2. Q-14成分分析
此外，对Q-14在体内的原型化合物（指在Q14和血浆中均观察到的化学成分）进行CTMT - NDRD追踪，以确定潜在的抗COVID-19生物活性化合物。使用代谢组学技术对灌胃Q-14后的血浆样本中的原型化合物进行了表征。共发现60种原型化合物，包括13种黄酮类化合物、9种三萜皂苷、8种生物碱、8种糖苷、5种酚酸、4种蒽醌、3种萜类、4种木脂素、2种脂肪酸和4种其他化合物（图3A）。同时对血液中这些药材和成分的数量进行了总结（图3B），其中有30种原型化合物可用于抗病毒和抗炎症筛选的后续实验。
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图3. Q-14入血原型成分分析
3. Q-14抗病毒化合物的筛选
为了从Q-14中筛选具有抗病毒作用的生物活性化合物，在生物安全水平（BSL）-2实验室建立了异位表达感染SARS-CoV-2样颗粒（trVLPs）的核衣壳（Caco-2-N）包装细胞系。发现10种化合物（厚朴酚、西北甘草异黄酮、甘草查尔酮B、甘草异黄酮A、大黄素、刺甘草查尔酮、异甘草素、大黄酸、槲皮素、和厚朴酚）具有显著的抗病毒活性，在100 μM浓度下的抑制率>90%（图4A）。鉴于初步筛选的令人鼓舞的结果，随后表征了前10个化合物的50%有效浓度（EC50）和50%细胞毒性浓度（CC50）值（图4B）。此外，选择性指数（SI）计算为CC50与抗病毒EC50的比值（CC50/EC50），这是测定系统中化合物治疗窗口的度量。厚朴酚、西北甘草异黄酮、甘草异黄酮A、大黄素、刺甘草查尔酮、槲皮素等6个SI > 5.0的化合物（图4B）具有较大的治疗窗口和良好的药物性。
考虑到它们在病毒复制和感染中的关键作用，SARS-CoV-2 Mpro和RdRp是抗病毒药物的有吸引力的靶点。因此对六个具有高SI的化合物基于荧光共振能量转移（FRET）的蛋白酶和体外聚合酶活性测定进行评价，并根据剂量-反应曲线计算半最大抑制浓度（IC50）值（图4C和D）。如图4C所示，槲皮素和刺甘草查尔酮在亚微摩尔水平上表现出中等的SARS-CoV-2 Mpro抑制活性，IC50值分别为35.14 μM和22.47 μM。此外，西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A对RdRp具有明显的抑制作用，IC50值分别为28.90 μM和47.31 μM（图4D）。
进一步利用分子对接来估计化合物与靶蛋白之间的结合相互作用，将槲皮素和刺甘草查尔酮停靠在SARS-CoV-2 Mpro上，将西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A停靠在RdRp上（图4E）。槲皮素、刺甘草查尔酮、西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A的结合能分别为−9.01、−7.78、−9.20和−9.01 kcal/mol。槲皮素和刺甘草查尔酮预计会与Mpro的Arg4和Lys5形成氢键（图4E）。此外，预计西北甘草异黄酮与Asn781、Ser784和Thr141形成氢键（图4E），甘草异黄酮A可能与Tyr129和Lys47形成氢键（图4E）。虽然付出了很大的努力，但遗憾的是没有得到任何复杂的结构，这是本研究的局限性，需要在未来进行探索。
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图4. Q-14抗病毒化合物的筛选
4. Q-14抗炎化合物的筛选
在基于SFTSV感染的炎症细胞模型上进一步评价Q-14化合物的抗炎活性。初步筛选Q-14中30个化合物对SFTSV感染的THP-1巨噬细胞的抗炎活性。在30种化合物中，甘草查尔酮B、西北甘草异黄酮和刺甘草异黄酮表现出最强大的抗炎活性（抑制率> 90%）（图5A）。为了验证这三种化合物的抗炎活性，分别用1.1、3.3和10 μM浓度的化合物处理感染SFTSV（MOI = 5）的THP1巨噬细胞。感染48小时后，这三种化合物均表现出剂量依赖性的抗炎活性。在已建立的SARS-CoV-2感染炎症细胞模型上，进一步评估了这三种化合物对SARS-CoV-2引发的炎症的抑制作用，所有三种化合物都以剂量依赖的方式降低了SARS-CoV-2诱导的IL-1β P17释放（图5 B和C）。
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图5.Q-14抗炎化合物的筛选
5. Q-14靶向PDE4的生物活性化合物筛选
4型磷酸二酯酶（PDE4）被认为在COVID-19进展过程中对中性粒细胞的激活和中性粒细胞介导的炎症反应至关重要，利用闪烁接近实验（SPA）对Q-14中的30个原型化合物进行了靶向PDE4的筛选。初步筛选发现10个化合物在50 μM浓度下抑制PDE4活性50%以上（图6A）。（-）-儿茶素-7-没食子酸酯和茯苓酸B均因其自身局限性被排除。由于其对多种靶标无差别的有活性，EGCG也被认为是一种潜在的泛分析干扰化合物（PAINS），在实践中，这些化合物表现出非特异性反应性，这可能干扰多个生物靶标并导致误导性结果。进一步筛选实验证实，在5 μM条件下，西北甘草异黄酮、槲皮素、甘草异黄酮A和甘草查尔酮B 4种化合物对PDE4的抑制效果最好，四种活性化合物的IC50值分别为1.29、17.35、1.77和5.73 μM（图6B）。
为了揭示这四种化合物与PDE4的结合模式，将它们浸泡在PDE4催化结构域的晶体中。发现这两种化合物占据了PDE4活性位点，并具有相似的结合模式。对详细相互作用的检查显示，西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A中的两个酚羟基与保守残基Q369和T333的侧链形成两个氢键（图5C）。此外，西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A的游离苯环上的羟基与相邻的水分子形成氢键。除了氢键相互作用外，这两个化合物还与残基N321、Y329、F372、I336、W332、M337、Y159和M357形成了广泛的疏水相互作用（图5C）。这些结果共同提供了PDE4识别西北甘草异黄酮和甘草异黄酮A的分子机制，以及基于结构对PDE4活性的有效抑制。
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图6. Q-14化合物对PDE4的抑制作用
中药入血研究方案
从本研究我们可以看出对于中药入血成分的分析是存在较为统一的思路的：
1. 对于中药入血成分分析可以结合代谢组学技术对中药植物和血液样本进行检测后，结合分子对接和一些体外的细胞实验来验证成分的功能。
2. 对于更加细致的中药药理研究则可以结合其他组学技术开展，这样的研究思路也在今年公布的2023年中医药学术十大进展有着典型的案例。具体文献参考以下链接：https://mp.weixin.qq.com/s/HPj70PvX_4Wb8E2I2f3BbQ
中药入血成分分析产品介绍
1. 4针检测：液相质谱联用高分辨质谱仪+低分辨质谱仪双管齐下
利用高分辨质谱仪采集成分的RT、二级质谱图等信息，与本地自建数据库进行物质信息匹配（二级镜像匹配）；其次利用低分辨质谱仪中业内金标准MRM模式对样本中的成分含量进行测定。
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物质鉴定二级镜像匹配
2. 自建本地数据库MetTCMTM：28000+种次生代谢成分
利用标准品在样本检测相同条件下建立完整的物质信息库，目前已建立包含有28000+种中药成分的物质库，广泛覆盖黄酮、萜类、生物碱、香豆素、木脂素、醌类等多种在中药中发挥药效作用的成分，数据库物种覆盖超过500+种《中国药典》2020版中的物种类型。
3. 严格的物质定性标准
对于中药研究来说，不论是对中药原始植物，还是经过炮制过程的中药药材，成分鉴定准确性对于后续药理的研究极其重要。因此我们针对物质鉴定建立严格的物质准确性标准，在交付结果中严格划分物质定性等级。
4. 物质鉴定水平
对于中药植物、中药复方、血液、动物组织样本，我们具有丰富的项目经验，对于中药植物、中药复方类型的样本，物质检出水平在1000-3000，对于血液和动物组织样本，物质检出水平在300-1000。极大程度的挖掘中药植物、复方、血液和组织中的中药成分。
5. 分析内容：网络药理学分析
对于中药的研究来说，成分鉴定只是第一步，下一步则是进行药理机制的研究。而在近日发布的2023年十大中医药学术进展中其中一个部分则是强调网路医学的使用，在我们的分析中，则将网络药理学分析内容作为标准分析进行交付。
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